Thermo Fisher Week 2 ePCR

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2022.03.10 저번 주에 이어 Thermo Fisher에서의 강의가 진행되었다.

진행되는 시간이 항상 교양 과목과 겹쳐서 녹화한 후 나중에 듣게되는 점이 너무 아쉽다. 

2주차 첫 파트로는 ePCR 교육이 진행되었는데 이제 막 분자생물학, 생화학을 배우고 있어

이해되지 않는 부분이 많아 여러번 돌려봤었다.

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PCR의 종류

ePCR : end point PCR로 일반적으로 사용되는 PCR이다. Semi quantitative PCR 이라고도 부른다.

         PCR 후 증폭된 DNA 산물을 전기영동을 통해 반정량적으로 확인한다. 

• Semi quantitative (반정량적) : 정확한 수치를 알 수 있는 정량적과 달리 대조군과의 비교만을 통해 수치의 증가/감소를 눈으로 확인 가능함

RT-qPCR : real time -qPCR로 시간에 따른 형광 염료를 실시간으로 확인하는 기술 mRNA나 유전자형 분석 등에 쓰임

 

1. DNA 구조와 합성 이해

 

DNA에 있는 유전정보는 RNA를 통해 전사되고 이것은 단백질 서열로 번역되어 생명현상을 조절한다.

DNA : Phosphate(인산기) - Sugar(5탄당) - Base (염기), Base 종류에 따라 ATGC로 구분

A=T. G≡C DNA합성은 인산기가 3번 탄소에 결합, 5->3 방향으로 합성

 

2. PCR의 원리

 

PCR (Polymerase Chain Reaction) 중합효소 연쇄 반응으로 DNA의 원하는 부분만을 증폭시키는 분자생물학 기술

 

필수요소 4가지 

DNA template - 증폭하고자 하는 타겟 DNA

dNTPs : dATP, dCTP, dGTP, dTTP로 합성 재료가 되는 nucleotide

PCR primers : DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열

DNA Polymerase : DNA 합성요소

 

3가지 단계

1. Denaturation : 이중 나선 구조인 DNA template에 합성요소가 붙을 수 있게 94 -97℃ 열을 가해 단일 가닥으로 만듬, dsDNA(겹가닥)를 ssDNA(외가닥)로 분리 
2.  Annealing : 55-65℃로 낮춰 증폭을 원하는 시작 부분에 Primer 결합
3. Extension : 70-74℃로 높혀 DNA template에 Nucleotide에 상보적인 Nucleotide를 가져와 DNA 합성을 위한 polymerase를 활성화 시킴

3가지 단계 -> 1Cylce(2^2), 일반적으로 30 ~ 40 Cylcle -> 10억개 이상 DNA 획득 가능

 

일반적인 효소 활성 온도 : 30 ~ 40℃

Polymerase가 70-74℃에 활성 가능한 이유 -> Taq polmerase : 호열성 세균인 Thermus aquaticus의 DNA 중합 효소,

3' -> 5'으로 Exonuclease의 수선이 없음 (실수로 합성된 DNA 수선 기능)

 

PCR을 위한 준비물

PCR components (시약), PCR thermal Cyclers, Pipette, PCR plastics, Gel electrophoresis system & reagents

PCR purification and gel extraction kits, workstation dedicated to PCR (BSC)

 

3. PCR workflow

1. DNA Isolation 

PCR에 필요한 높은 수율과 순도의 DNA Template를 추출

조직이나 혈액 세포에서 Genomic DNA 또는 플라스미드 DNA 분리

Organic extraction, spin culmn, magnetic beads 방식 존재

 

2. Primer design

증폭을 원하는 부분의 시작점이 되는 Primer가 Template에 정확히 붙도록 디자인

정확히 디자인 못하면 다른 부분이 증폭되어 결과 도출 불가

Tm (melting temperature dsDNA가 ssDNA로 Denaturation되는 온도변화의 중간값

Primer와 DNA Template의 결합- 듀플렉스의 안정성이 Tm 값에 의해 결정

DNA 길이나 염기 조성에 따라 변하기 떄문에 별도의 식이 존재

프라이머는 두가닥의 DNA에 붙기 때문에 센스, 포워드/리버스부분 안테센스 2가지가 필요

-> 별도로 프라이머를 제작해주는 사이트 – Oligoperfect Primer Design

Anealing 온도는 Tm보다 2-3도 적게 설정하면 Primer가 잘 붙음

 

3. Enzyme Selection

가장 많이 비교, 고려해야하는 부분

Primer, Template 제외하고 가장 중요한 Polymerase 선택

 

• Stand alone : 각각 요소를 튜브에 담아 판매되며 개별적인 Pipetting 필요
• Master Mix : Single tube에 모든 요소가 담겨 있어 여러번의 Pipetting 불필요 
• Green :  색을 내는 물질 함유되어 Pipetting, Gel electrophoresis 할 때 도움을 줌

Polymerase 스펙에 따라 PCR 종류가 달라짐

 

Hot-Start DNA Polymerase

Taq polymerase 문제점 : Polymerase가 Denaturation, Anealing 이후 활성화 되어야 하는데 시약을 섞은 실온이나 온도가 올라가는 앞 시점에서 활성화, -> 비특이적 부분 활성

Polymerase를 개량하여 Denaturation 이후에만 활성화 – Hot-Start DNA Polymerase, 양이나 순도가 확연히 차이남

 

Ex) 좀 더 특이적으로 원하는 DNA만 증폭 – Genotyping, Cloning, Sanger Sequencing template

 

 

High-Difelity PCR

Hot start로도 해결이 안될 때, Squence 합성 중, Extension 중 오류가 생길 때

Downstream application인 Cloning 또는 PCR 산물 Sequencing에서 Troubleshooting을 해야함

Taq Polymerase는 Exonuclease (자동 수정) 기능이 없지만 High-fidelity Polymerase는 교정을 통해 

정확한 DNA 서열을 합성함

 

Reverse Transcription PCR, RT-PCR

 

RNA를 template로 하여 이에 상응하는 cDNA(completementary DNA 합성과정)

역전사 과정없이  RNA 복제안되는 이유 : 단일가닥이라 불안정, 반감기 짧음, Rnase, RNA분해효소가 많아 힘듬

 

1. RNA isolation

2. Primer design

cDNA 합성하기 위해 사용되는 3가지 종류, RT-PCR 방법에 따라 선택

Oligo(dT) primer , Random primer, Gene-specitic primer(GPS) 중 하나 선택

 

3. Enzyme selection

역전사효소 선택

One step : RT,PCR 동시 진행, 빠른 protocol, few target, cDNA 보관 x, 대량작업 적합 Pipetting step 줄어듬, 오염 위험 낮음, gene specific primer

Two step : RT, PCR 따로 진행, many target, cDNA 보관가능 대량 작업 부적합

 

RNA 역전사 효소

RNase H : cDNA 합성 시 DNA와 하이브리드된 RNA 제거, 너무 강하면 cDNA에 방해

SuperScript 제품

https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/BID/brochures/rna-isolation-purification-brochure.pdf

 

4. Thermal Cycling

Tube 종류 : Single tube, Strip, Plate

 0.1ml fast thermal cycler block 사용 시 low-profile tube 사용

Flat lids 형태의 pcr 장비는 flat caps 사용

안쪽이 오목하게 들어간 뚜껑이면 domed caps

Strip 뚜껑등

96well 선택 : 장비에 맞게 skirt type, deck style

Applied biosystems – ABI Cycler

Plate coose

https://www.thermofisher.com/kr/ko/home/life-science/pcr/pcr-plastics.html?CID=fl-pcrplastics

plastic choose

https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/thermo-scientific-pcr-plastics-selection-guide.pdf

 

5. Amplicon analysis

DNA가 잘 얻어졌는 지 확인 -> Electrphoeresis 전기영동

DNA, RNA 단백질과 같이 고유의 전하를 띠고 있는 물질을 Gel에 놓고 전류를 흘려 보내 이동시켜 크기에 따라 분리