Thermo Fisher Week 4 HPLC Basic

week4에서는 HPLC 기초에 대한 설명이였으며 전공 시간에 배운 내용이라 이해가 비교적 쉬웠다

 

Chromatography

혼합물인 시료를 고정상(Stationary phase)과 이동상(mobile phase) 간의 물리, 화학적인 차이(분배, 흡착, 이온교환 등)를 이용해서 각각의 성분으로 분리하여 적절한 검출기를 이용하여 검출 후 정량, 정성 하는 방법

이동상에 따라 명칭이 달라진다.

 

3가지 목적: 정성 정량 분획

 

Peek가 제대로 분리되었는지 확인 - Chromatographic Parameter

• Retention Time(tr): 용질이 컬럼을 빠져나오는데 걸리는 시간
• System peak, mobile phase retention time(tm): 이동상이 컬럼을 빠져나오는데 걸리는 시간, 시료가 제대로 주입되지 않는다면 보이지 않을 수 있음
• Chromatogram: 시간에 따리 peek가 분리되는 것을 검출기를 이용해 도식화 하는 것 x축이 시간, Detector signal vs Retention time
• Spectrum: x축이 파장, Detector signal vs wavelength or molecular weight
• Resolution, R: 분리능, 두 peak의 분리된 정도를 표시해주는 값

 

Resolution 향상을 위한 Parameter

 

 

 

컬럼 내에 단이 연속으로 연결되어 있고 각각의 단에서 분배평형이 일어나 물질이 분리되어,

이론단의 수가 많을수록 컬럼 효율이 높다는 이론, 값이 클수록 컬럼 효율이 좋다

N=L/H, 길이가 길수록 효율 증가, 압력증가, 분석시간 증가 / 컬럼 충전 입자의 직경이 작을수록 효율증가, 압력 증가

N=1 이면 물질이 이동상과 고정상에 1대1로 흡착 반복, 분배평형이 일어남

 

Capacity factor, K’: 시료의 머무름을 나타내는 지표

K’ 값에 영향을 주는 요소: 컬럼 리간드 종류, 이동상의 조성

Tr은 일정한 유속에서 시료에 따라 특정한 값을 나타냄

K’ = 0일 경우, 시료가 컬럼에 전혀 머무르지 않고 용출

K’ = 1일 경우, 시료가 tm의 2배 되는 곳에서 용출

1<k’<5일 경우, 시료가 이상적으로 용출

 

Selectivity, Separation factor: α

α는 두 성분의 분리 정도를 나타내는 척도

α=1인 경우, 두 피크는 분리되지 않은 상태를 나타냄

α > 1,2인 경우 바람직한 분리를 나타냄

용질의 α는 정지상과 이동상의 종류에 따라 다른 값을 가짐

 

 

HPLC 구성

Solvent tray/Degasser -> Pump -> Autosampler -> Column compartment -> Detector

 

Pump

 

Check valve가 역류 방지

Pump 종류: ISO, LPG, HPG, DGP등 이 있음

LPG, HPG가 주로 사용됨

LPG: 하나의 펌프헤드, Proportioning valve-최대 4가지 용매 혼합 가능, 분석법 개발에 유용

HPG: 두 개의 펌프헤드에 각 셀렉션 밸브가 달려 최대 2개 용매 혼합 가능, Gradiant delay volume이 적음

Mixing point가 뒤쪽에 있어 분석시간 단축 가능

Capillary mixer, static mixer에서 완전히 혼합

Autosampler

시료를 자동으로 기기로 주입하는 역할

 

Load position-injection position을 6 port valve를 이용하여 조절

두 가지 방식

Pulled-loop injection

Loop가 valve에 연결, needle이 loop와 떨어져 있음 sample로 needle을 와싱-sample 소모량 많음

다음 시료에 영향을 주기 쉬우며 현재 잘 사용 x

Split-loop modules

Loop-needle 연결, 시료를 바로 뽑아 주입 가능, sample 소모량 적으며 Carryover 줄일 수 있음

 

Colum

실제로 LC에서 분리가 일어나 중요한 부분

스테인리스-스틸하드웨어 재질, 내부에 구형 파티클 충진, 안쪽에 이동상이 계속 흐름, 혼합물질이 들어와 각각의 단일 물질로 분리, 컬럼과 상호작용이 적은 것이 빠르게 빠져나감

파티클 사이즈가 작을수록 컬럼 효율이 좋다

• 순상 크로마토그래피(Nomal Phase Chromatography): 분자의 극성 차이를 바탕으로 분리, 이동상의 극성이 고정상의 극성보다 낮을 때, 주로 극성 물질, 유기용매 사용, 구조이성질체분리, 압력이 적어 부하가 적음, 컬럼 수명 김, 물에는 취약- 분석 폭이 좁음
• 역상 크로마토그래피(Reverse Phase Chromatography): 분자의 극성 차이를 바탕으로 분리- Chromatography의 80%비극성 그룹이 결합, 극성 이동상, 비극성 물질에 사용
• 이온교환 크로마토그래피(Ion pairing/Ion Exchange Chromatography): 분자의 전하 차이를 바탕으로 분리, 분석물질이 전하를 띄는 경우, 이온 또는 하전된 성분이 정전기적 힘에 의해 결합, 분리 이용
• 사이즈 배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography): 분자의 크기 차이를 바탕으로 분리

밀도에 따른 역상 크로마토 그래피

 

컬럼오븐- 컬럼의 온도 조절

적절한 온도로 해야 재현성을 얻을 수 있음

온도 증가 – 점도 감소 – rt 빨리 검출 – resolution 상승

 

 

 

Detector

컬럼에서 분리한 물질을 확인하는 장비

UV/Vis: 가장 많이 사용됨, UV를 흡수 가능한 발색단이 있어야 함, 성분의 양이 많을수록 피크 크기 증가

Diode-array Detector (DAD): 광원 이용, 검출하는 부분이 전 영역의 파장의 빛을 분사 후 검출하는 것이 특징, 3D 파장에 대한 정보를 얻을 수 있어 spectrum으로 알 수 있음, 새로운 시료에 사용 가능

Fluorescence Detector (FLD): 형광검출기, 방출되는 빛을 검출, 감도가 매우 좋음, 넓은 범위의 농도 구간에서 분석 가능, 응용범위가 제한적

Refractive index (RI): 빛의 굴절률을 이용, 온도 차이에 민감, 감도가 낮음

Evaporative light scattering detector (ELSD): 질소 Nebulizer로 기화하여 이용, 미량분석 가능, Gradiant 조건 사용 가능, 시료가 휘발성이 있으면 검출 x

Charged Aerosol Detector (CAD): mRNA 백신 개발에 있어 Liquid nano particle 성분 검출기로 기여

하전된 전자 개수를 측정, 표준품이 없는 물질 분석에 있어 장점이 있음