Thermo Fisher Week 4 HPLC Column Selection

지난 HPLC 기초 강의에 이어 HPLC에서 중요한 부분인 Column 선택 가이드에 대한 강의가 진행됐다

 

컬럼 기본 이론 및 선택 가이드

HPLC 분석 물질은 모두 용액에 녹여진 상태

물질이 어디에 잘 녹는 지 알아야함

이후 컬럼에 주입

 

Column Seclection – 스펙 위주로 분류

 HPLC Column material

 

분리모드에 따른 분류

 순상(Normal Phase) 분리

고정상(극성)에 시료의 극성기가 흡착과 탈착을 반복하며 분리, 이동상(비극성)

Dipole-dipole interaction

 

역상(Reversed Phase) 분리

고정상(비극성)에 시료의 극성기가 흡착과 탈착을 반복하며 분리, 이동상(극성)

Hydrophobic interaction, 물에 녹는 물질들

 

흡착제(adsorbent)에 따른 분류

 

실리카(Silica)계

Resolution, Price, Pressure에 장점, 산과 염기에 제한

 

폴리머(Polymer)계

산과 염기에 강함, 잔존 Silanol의 영향x, 실리카에 비해 분리능 및 내압성이 떨어지고 비쌈

 

Column-분석대상물질

 분석대상물질의 성질, 유래, 시료농도, 분석시간들을 고려하여 적절한 컬럼 선택

 

전혀 물에 녹지 않는 경우, 물과 층 분리가 되는 물질 ex) 핵산

->순상으로 선택

 

일반적인 화합물

-> 역상으로 선택, 역상 컬럼은 품질이 안정되어 있고 조작이 간편하며 재현성이 좋음

 

분석대상물질을 크게 5가지로 나누어 분류

1) 저분자 화합물 – 일반적인 Column

     ① 분석대상이 물에 녹지 않는 경우

           -순상으로 선택

           -흡착이 강한 순서로 Silica, NH2 CN이 있음

           -최초에 Silica Column을 선택

     

     ② 일반적인 화합물

          -역상으로 선택

          -흡착이 강한 순서로 C18, C8, Phenyl, C1, CN이 있음

          -최초에 C18 Column을 선택

      

     ③ 이온성물질: 분석방법에 따라 컬럼 선정

          a.이온페어법

             -역상으로 선택

             -C18 Column을 선정, 이동상에 이온페어제를 첨가하여 분석

          b. 이온교환법

             -산성물질: 음이온교환 컬럼을 선정, NH2 Column으로 먼저 접근

             -염기성물질: 양이온교환 컬럼을 선정, SCX Column으로 먼저 접근

 

2) 고분자 화합물(분자량 10,000~) – Pore Size 150A 이상의 Column

    ① 단백질의 분석

         -역상분리: C18 300Å or C8 300 Å (분자량 10,000~200,000)

    ② 단백질 이외의 화합물

         -분자량 및 용해도에 따라 적합한 컬럼을 선정

 

3) 당류 – Hypersil Gold Amino & Ion-exchange Column

4) 광학이성질체 – 이성질체 전용 Column

 

일반적인 컬럼의 규격

Flow rate

내경에 따라 정해짐

1) 적절한 Flow rate 이상 흘릴 경우 -> 컬럼에 압력이 높아짐 (기기 & 컬럼의 내압성)

2) 적절한 Flow rate 이하 흘릴 경우 -> 분석시간이 길어지며 Peak의 모양도 Broad 해짐(확산효과)

내경이 줄어들면 농축효과로 인하여 같은 농도라도 Peak의 크기가 크게 나타난다 -> LOD의 증가

 

컬럼 내경을 줄일 시 고려사항

1) System

    -System의 Volume

    -내압성 (컬럼 & System)

2) 분석 Sample

    -컬럼에서의 반응성

    -내경이 작아지면 컬럼의 부피도 작아져 허용 가능한 주입량도 줄어듬

 

 

Particle 크기에 따른 Chromatogram

일반적인 LC도 HPLC와 유사한 성능을 띄게 도와주는 Particle