Cell culture Protocol

 

 

1. 동결 해지 (Thawing) -> 세포 배양 (Cell culture)

 

1) -70℃ 또는 액체질소에 보관 하던 세포를 꺼내와 Water bath 37℃에서 빠르게 녹여준다.

2) 녹인 세포를 Conical tube에 옮긴 후 Media 3ml (양 중요 x) 넣고 Centrifuge 돌려준다.

3) Centrifuge에서 tube를 꺼내고 Pellet(가라앉은 세포)만 남기고 배지를 Suction 해준다.

4) Pellet만 남은 Tube에 새로 Media를 2ml 넣고 Resuspension 해준다.

5) Dish에 Media 9ml을 넣어주고 4)의 세포 2ml을 넣어준 후 수평방향으로 살살 흔들어준다.

6) Dish를 Incubator에 조심히 넣어둔다.

해동 전 Cryo-vial 내 세포

 

 

 

2. Sub-Culture

 

1) Water bath 37℃ 맞춘 후 PBS, Media를 넣어둔다.

2) Incubator에서 세포를 꺼낸다.

3) Suction으로 Media를 제거한다.

4) PBS 3ml (양 중요 x) Washing - Suction 2회 실시한다.

5) TrypLE 0.5ml 처리 후 Incubator에 10분 넣어둔 후 현미경에 올리고 적당히 치면서 확인한다.

6) Conical tube에 옮기고  Media 3ml 넣어준 후 Centrifuge 돌려준다.

7) Centrifuge에서 tube를 꺼내고 Pellet(가라앉은 세포)만 남기고 배지를 Suction 해준다.

8) Pellet만 남은 Tube에 새로 Media를 2ml 넣고 Resuspension 해준다.

9) 10μl뽑아서 Hemacytometer로 세포 수를 센다. 100pi 기준 1 x 10^6 가 적당, 세포마다 다름

10) Dish Labeling [ 배지 이름 / 세포 명 / Passage number / 세포 양 / 날짜 / 실험자 명]

11) Dish에 Media 9ml을 넣어주고 8)의 세포 2ml을 넣어준 후 수평방향으로 살살 흔들어준다.

12) Dish를 Incubator에 조심히 넣어둔다.

 

3. 세포 동결

 

동결배지조성: 50% culture media, 40% FBS, 10% DMSO

1. 충분한 수의 세포를 동결배지로 suspension한 후 1 mL씩 cryo-vial에 넣는다.
2. Cryo-vial을 꼭 닫은후 label 한다.

3. Para film으로 잘 감아주고 -70℃ 냉동고에 넣어준다.

(수정필요)

 

시약 정보

 

PBS(Phosphate Buffer Saline 인산완충식염수) 세척 이유 : FBS 성분 중 Trypsin을 불활성화 시키는 물질이 있기 때문, 세포는 고유 pH와 삼투농도를 가지는데 그것과 유사한 것이 PBS, 세포 부담 감소

 

Trypsin-EDTA : 단백질 분해 효소의 한 종류로 Dish와 동물세포, 동물세포와 동물세포 간의 부착단백질을 분해하지만 오래 처리할 경우 세포 막 단백질을 분해하여 부정적인 영향을 끼침

 

TrypLE : Trypsin과 사용법 / 사용량이 동일하지만 비교적 안정적이고 효과적

 

DMSO(동결보호제)를 사용하는 이유
세포 동결시 세포내 물 분자가 수소 결함에 의해 얼면서 Ice crystal현상이 일어나면 뾰족한 모양을 하면서 어는 intracellular ice crystalization이 일어나는데, 때문에 세포에 큰 damage를 줄 수 있다. 하지만 DMSO를 넣게 되면 이러한 수소 결합을 어느 정도 방해하여 뾰족한 결정이 생기지 않게 해준다.